2 × Pfu PCR -mengsel

A-1 sjabloon

■ Die sjabloon bevat proteïen -onsuiwerhede of Taq -remmers, ens .—— Suiwer DNA -sjabloon, verwyder proteïen onsuiwerhede of onttrek sjabloon -DNA met suiweringstelle.

■ Die denaturering van die sjabloon is nie voltooi nie —— Verhoog die denatureringstemperatuur op die regte manier en verleng die denaturatietyd.

■ Die agteruitgang van die sjabloon —— Maak die sjabloon weer gereed.

A-2 Primer

■ Swak kwaliteit van primers —— Her sintetiseer die primer.

■ Primerafbraak —— Maak die primers met 'n hoë konsentrasie in klein hoeveelhede toe vir bewaring. Vermy veelvuldige bevriesing en ontdooiing of langtermyn-4 ° C-gebergte.

■ Onbehoorlike ontwerp van primers (bv. Primerlengte nie voldoende nie, dimeer gevorm tussen primers, ens.) -Hersig primers (vermy vorming van primer dimeer en sekondêre struktuur)

A-3 mg²⁺konsentrasie

■ Mg²⁺ konsentrasie is te laag —— Behoorlik verhoog Mg²⁺ konsentrasie: optimaliseer die Mg²⁺ konsentrasie deur 'n reeks reaksies van 1 mM tot 3 mM met 'n interval van 0,5 mM om die optimale Mg te bepaal²⁺ konsentrasie vir elke sjabloon en onderlaag.

A-4 Onthardingstemperatuur

■ Die hoë uitgloeitemperatuur beïnvloed die binding van primer en sjabloon. - Verlaag die uitgloeitemperatuur en optimaliseer die toestand met 'n helling van 2 ° C.

A-5 Uitbreidingstyd

■ Kort verlengingstyd —— Verleng uitbreidingstyd.

Verskynsels: Negatiewe monsters toon ook die doelvolgordebande.

A-1 Besmetting van PCR

■ Kruisbesmetting van teikensekwensie of versterkingsprodukte —— Moenie die monster wat die teikensekwens bevat, in die negatiewe monster laat pipet of uit die sentrifugebuis mors nie. Die reagense of toerusting moet outoklaaf word om bestaande nukleïensure uit te skakel, en die bestaan ​​van besmetting moet bepaal word deur middel van negatiewe kontrole -eksperimente.

■ Besmetting van reagense —— Maak die reagense uit die mengsel en bewaar teen lae temperatuur.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ konsentrasie is te laag —— Behoorlik verhoog Mg²⁺ konsentrasie: optimaliseer die Mg²⁺ konsentrasie deur 'n reeks reaksies van 1 mM tot 3 mM met 'n interval van 0,5 mM om die optimale Mg te bepaal²⁺ konsentrasie vir elke sjabloon en onderlaag.

■ Onbehoorlike onderlaagontwerp, en die doelvolgorde het 'n homologie met die nie-teikenvolgorde. —— Herontwerp primers.

Verskynsels: Die PCR-versterkingsbande is in stryd met die verwagte grootte, óf groot óf klein, of soms kom beide spesifieke versterkingsbande en nie-spesifieke versterkingsbande voor.

A-1 Primer

■ Swak primer -spesifisiteit

—— Herontwerp primer.

■ Die primer -konsentrasie is te hoog —— Verhoog die denatureringstemperatuur behoorlik en verleng die denaturatietyd.

A-2 mg²⁺ konsentrasie

■ Die Mg²⁺ konsentrasie is te hoog —— Verminder die Mg2+ -konsentrasie korrek: optimaliseer die Mg²⁺ konsentrasie deur 'n reeks reaksies van 1 mM tot 3 mM met 'n interval van 0,5 mM om die optimale Mg te bepaal²⁺ konsentrasie vir elke sjabloon en onderlaag.

A-3 termostabiele polimerase

■ Oormatige hoeveelheid ensiem —— Verminder die hoeveelheid ensiem korrek met tussenposes van 0,5 U.

A-4 Onthardingstemperatuur

■ Die uitgloeitemperatuur is te laag —— Verhoog die uitgloeiingstemperatuur toepaslik of gebruik die tweestadige uitgloeiingsmetode

A-5 PCR-siklusse

■ Te veel PCR -siklusse —— Verminder die aantal PCR -siklusse.

A-1 Primer—— Swak spesifisiteit —— Herontwerp die onderlaag, verander die posisie en lengte van die onderlaag om die spesifisiteit daarvan te verbeter; of voer geneste PCR uit.

A-2 Sjabloon-DNA

—— Die sjabloon is nie suiwer nie—— Suiwer die sjabloon of onttrek DNA met suiweringstelle.

A-3 mg²⁺ konsentrasie

——Mg²⁺ konsentrasie is te hoog —— Verlaag Mg behoorlik²⁺ konsentrasie: optimaliseer die Mg²⁺ konsentrasie deur 'n reeks reaksies van 1 mM tot 3 mM met 'n interval van 0,5 mM om die optimale Mg te bepaal²⁺ konsentrasie vir elke sjabloon en onderlaag.

A-4 dNTP

—— Die konsentrasie van dNTP's is te hoog —— Verminder die konsentrasie van dNTP op die regte manier

A-5 Onthardingstemperatuur

—— Te lae uitgloeitemperatuur —— Verhoog die uitgloeiingstemperatuur gepas

A-6 siklusse

- Te veel siklusse - Optimaliseer die siklusgetal

Die eerste stap is om die gepaste polimerase te kies. Gereelde Taq-polimerase kan nie proeflees nie as gevolg van 'n gebrek aan 3'-5'-eksonuklease-aktiwiteit, en wanverhouding sal die uitbreidingsdoeltreffendheid van fragmente aansienlik verminder. Daarom kan gereelde Taq -polimerase nie doelwitfragmente groter as 5 kb effektief versterk nie. Taq -polimerase met spesiale modifikasie of ander hoëgetroue polimerase moet gekies word om die doeltreffendheid van die verlenging te verbeter en aan die behoeftes van langfragmentversterking te voldoen. Boonop vereis die versterking van lang fragmente ook ooreenstemmende aanpassing van die onderlaagontwerp, denatureringstyd, verlengingstyd, buffer-pH, ens. Gewoonlik kan primers met 18-24 bp tot beter opbrengs lei. Om die beskadiging van die patroon te voorkom, moet die denatureringstyd by 94 ° C verminder word tot 30 sekondes of minder per siklus, en die tyd om die temperatuur te verhoog tot 94 ° C voor versterking moet minder as 1 minuut wees. Boonop kan die verlengingstemperatuur op ongeveer 68 ° C gestel word en die verlengingstyd volgens die snelheid van 1 kb/min ontwerp word, effektiewe versterking van lang fragmente verseker.

Die foutsyfer van PCR -versterking kan verminder word deur verskillende DNA -polimerases met hoë getrouheid te gebruik. Onder al die Taq DNA -polimerases wat tot dusver gevind is, het Pfu -ensiem die laagste foutkoers en die hoogste getrouheid (sien aangehegte tabel). Benewens die seleksie van ensieme, kan navorsers die PCR -mutasietempo verder verlaag deur die reaksietoestande te optimaliseer, insluitend die optimalisering van buffersamestelling, konsentrasie van termostabiele polimerase en die optimalisering van die PCR -siklusgetal.