TIANSeq NGS -biblioteekversterkingsmodule

Tans is die sekwensiëringstegnologie met 'n hoë deurset hoofsaaklik gebaseer op die volgende generasie opeenvolgingstegnologie. Aangesien die leeslengte van die volgende generasie opeenvolgingstegnologie beperk is, moet ons die volgorde in volle lengte in klein fragmentbiblioteke opbreek om te volg. Volgens die behoeftes van verskillende opeenvolgingseksperimente, kies ons gewoonlik opeenvolgende opeenvolging of dubbeleindige opeenvolging. Tans word die DNA-fragmente van die volgende generasie volgordebiblioteek oor die algemeen versprei in die reeks van 200-800 bp.

a) DNA is swak van gehalte en bevat remmers. Gebruik DNA-monsters van hoë gehalte om remming van ensiemaktiwiteit te voorkom.

b) Die hoeveelheid DNS-monster is onvoldoende wanneer PCR-vrye metode gebruik word om DNA-biblioteek te bou. As die inset van die gefragmenteerde DNA 50 ng oorskry, kan PCR-vrye werkstroom selektief uitgevoer word tydens die konstruksieproses van die biblioteek. As die kopienommer van die biblioteek te laag is om direk in volgorde te volg, kan die DNA -biblioteek versterk word deur PCR na die adapterligasie.

c) RNS -besmetting lei tot onakkurate aanvanklike DNA -kwantifisering RNA -besmetting kan bestaan ​​in die suiweringsproses van genomiese DNA, wat kan lei tot onakkurate DNA -kwantifisering en onvoldoende DNA -laai tydens biblioteekkonstruksie. RNA kan verwyder word deur met RNase te behandel.

A-1

a) Klein fragmente (60 bp-120 bp) verskyn Klein fragmente is gewoonlik adapterfragmente of dimere wat deur adapters gevorm word. Suiwering met Agencourt AMPure XP magnetiese krale kan hierdie adapterfragmente effektief verwyder en die opeenvolgingskwaliteit verseker.

b) Groot fragmente verskyn in die biblioteek na PCR -amplifikasie. Die grootte van die biblioteek -DNA -fragment sal met 120 bp toeneem nadat die adapter geligeer is. As die DNA -fragment na die adapterligasie met meer as 120 bp toeneem, kan dit veroorsaak word deur abnormale fragmentversterking van oormatige PCR -amplifikasie. Deur die aantal PCR -siklusse te verminder, kan die situasie voorkom word.

c) Abnormale grootte van biblioteek -DNA -fragmente na adapterligasie Die lengte van die adapter in hierdie kit is 60 bp. As die twee ente van die fragment aan die adapters vasgemaak word, sal die lengte slegs met 120 bp toeneem. As u 'n ander adapter gebruik as die wat deur hierdie kit voorsien word, kontak die verskaffer om relevante inligting soos die lengte van die adapter te verskaf. Maak asseblief seker dat die werkstroom en werking van die eksperiment die stappe volg wat in die handleiding beskryf word.

d) Abnormale DNA -fragmentgrootte voor die adapterligasie Die rede vir hierdie probleem kan veroorsaak word deur verkeerde reaksietoestande tydens DNA -fragmentering. Verskillende reaksietye moet gebruik word vir verskillende DNS -insette. As die DNS-inset meer as 10 ng is, word dit aanbeveel om die reaksietyd van 12 minute as die aanvangstyd vir optimalisering te kies, en die fragmentgrootte wat tans geproduseer word, is hoofsaaklik tussen 300-500 bp. Gebruikers kan die lengte van DNA-fragmente vir 2-4 minute vergroot of verminder volgens hul eie vereistes om die DNA-fragmente met die vereiste grootte te optimaliseer.

A-2

a) Fragmentasie tyd is nie geoptimaliseer nie. As die gefragmenteerde DNA te klein of te groot is, raadpleeg die riglyne vir die keuse van fragmentasie tyd in die instruksie om die reaksietyd te bepaal, en gebruik hierdie tydpunt as 'n kontrole, stel ook 'n reaksiestelsel om 3 minute te verleng of te verkort om die fragmenteringstyd akkurater aan te pas.

A-3

Abnormale grootteverspreiding van DNA na fragmentasiebehandeling

a) Verkeerde ontdooiingsmetode van fragmenteringsreagens, of die reagens word nie heeltemal gemeng na ontdooiing nie. Ontdooi die 5 × Fragmentation Enzyme Mix reagens op ys. Sodra dit ontdooi is, meng die reagens eweredig deur saggies aan die onderkant van die buis te draai. Moenie die reagens draai nie!

b) Die DNS -insetmonster bevat EDTA of ander besoedelingstowwe Uitputting van soutione en chelaatvormers in die DNA -suiweringstap is veral belangrik vir die sukses van die eksperiment. As DNA in 1 × TE opgelos is, gebruik die metode in die instruksie om fragmentasie uit te voer. As die EDTA -konsentrasie in die oplossing onseker is, word dit aanbeveel om die DNA te suiwer en dit in gedeïoniseerde water op te los vir daaropvolgende reaksie.

c) Onakkurate aanvanklike DNA -kwantifisering Die grootte van gefragmenteerde DNA hang nou saam met die hoeveelheid DNS -insette. Voordat fragmentasie behandel word, is akkurate kwantifisering van DNA met behulp van Qubit, Picogreen en ander metodes noodsaaklik om die presiese hoeveelheid DNA in die reaksiestelsel te bepaal.

 d) Die voorbereiding van die reaksiestelsel volg nie die instruksies nie. Die voorbereiding van gefragmenteerde reaksiestelsel moet streng volgens die instruksies op ys uitgevoer word. Om die beste effek te verseker, moet alle reaksiekomponente op ys geplaas word en moet die reaksiestelsel voorberei word nadat dit heeltemal afgekoel het. Nadat die voorbereiding afgehandel is, blaai of pipet om deeglik te meng. Moenie draai nie!

1. Onbehoorlike mengmetode (draaikolk, gewelddadige ossillasie, ens.) Sal abnormale verspreiding van biblioteekfragmente veroorsaak (soos in die volgende figuur getoon), wat die kwaliteit van die biblioteek beïnvloed. Wanneer u die Fragmentation Mix -reaksieoplossing voorberei, moet u dit dan saggies op en af ​​pipetteer om te meng, of gebruik die vingerpunt om eweredig te flikker en te meng. Wees versigtig om nie met die draaikolk te meng nie.

2. Hoë suiwerheids -DNA moet gebruik word vir die bou van biblioteke

■ Goeie DNA -integriteit: Die elektroforese -band is meer as 30 kb, sonder stert

■ OD260/230:> 1,5

■ OD260/280: 1,7-1,9

3. Die hoeveelheid DNA -insette moet akkuraat wees. Dit word aanbeveel om Qubit- en PicoGreen -metodes te gebruik om DNA te kwantifiseer, eerder as Nanodrop.

4. Die inhoud van EDTA in DNA -oplossing moet bepaal word EDTA het 'n groot invloed op die fragmenteringsreaksie. As die inhoud van EDTA hoog is, moet DNA -suiwering voor die daaropvolgende toets uitgevoer word.

5. Die fragmentasie -reaksie -oplossing moet op ys voorberei word. Die fragmentasieproses is sensitief vir reaksietemperatuur en -tyd (veral na toevoeging van enhancer). Om die akkuraatheid van die reaksietyd te verseker, berei die reaksiestelsel op ys voor.

6. Die fragmentasie -reaksietyd moet akkuraat wees. Die reaksietyd van die fragmentasie -stap sal die grootte van die fragmentprodukte direk beïnvloed en sodoende die grootteverspreiding van DNA -fragmente in die biblioteek beïnvloed.

1. Watter tipe monster is van toepassing op hierdie kit?

Die toepaslike monstertipe van hierdie kit kan totale RNA of gesuiwerde mRNA wees met goeie RNA integriteit. As totale RNA gebruik word om die biblioteek te bou, word dit aanbeveel om eers die rRNA -uitputtingstel (Cat#4992363/4992364/4992391) te gebruik om eers rRNA te verwyder.

2. Kan FFPE -monsters gebruik word om biblioteek met hierdie kit te bou?

Die mRNA in FFPE -monsters sal tot 'n sekere mate gedegradeer word, met relatiewe swak integriteit. As u hierdie kit vir die biblioteekkonstruksie gebruik, word dit aanbeveel om die fragmenteringstyd te optimaliseer (die fragmenteringstyd verkort of nie fragmentasie uitvoer nie).

3. Wat kan veroorsaak dat die ingevoegde segment effens afwykend kan lyk as u die groottekeuse in die produkhandleiding gebruik?

Grootte -seleksie moet streng uitgevoer word in ooreenstemming met die grootte -seleksiestap in hierdie produkhandleiding. As daar afwyking is, kan die rede hiervoor wees dat die magnetiese krale nie tot kamertemperatuur gebalanseer is nie of nie heeltemal gemeng is nie, die pipet nie akkuraat is nie of die vloeistof in die punt bly. Dit word aanbeveel om die wenke met 'n lae adsorpsie vir die eksperiment te gebruik.

4. Keuse van adapters in biblioteekbou

Die konstruksiekit van die biblioteek bevat geen adapterreagens nie, en dit word aanbeveel om hierdie kit saam met TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378) te gebruik.

5. QC van die biblioteek

Biblioteek kwantitatiewe opsporing: Qubit en qPCR word gebruik om die massakonsentrasie en molêre konsentrasie van die biblioteek onderskeidelik te bepaal. Die operasie is streng in ooreenstemming met die produkhandleiding. Die konsentrasie van die biblioteek sal oor die algemeen aan die vereistes van NGS -volgorde voldoen. Opsporing van biblioteekverspreidingsbereik: Gebruik Agilent 2100 Bioanalyzer om die verspreidingsbereik van die biblioteek op te spoor.

6. Keuse van versterkingsiklusnommer

Volgens die instruksies is die aantal PCR-siklusse 6-12, en die aantal PCR-siklusse wat benodig word, moet volgens die steekproefinvoer gekies word. In biblioteke met 'n hoë opbrengs vind oorversterking gewoonlik in verskillende grade plaas, wat manifesteer deur 'n effens groter piek na die piek van die doelwitbereik by die opsporing van Agilent 2100 Bioanalyzer, of die bespeurde konsentrasie van Qubit is laer as die van qPCR. Matige oorversterking is 'n normale verskynsel, wat nie die volgorde van biblioteke en die daaropvolgende data -analise beïnvloed nie.

7. Spykers verskyn in die opsporingsprofiel van Agilent 2100 Bioanalyzer

Die voorkoms van spykers tydens die opsporing van Agilent 2100 Bioanalyzer is as gevolg van die ongelyke fragmentering van monsters, waar daar meer fragmente in 'n sekere grootte sal wees, en dit sal duideliker word na verryking van PCR. In hierdie geval word aanbeveel dat u nie die grootte seleksie uitvoer nie, dit wil sê dat die fragmentatietoestand 15 minute lank op 94 ° C gestel word, waar die fragmentverspreiding klein en gekonsentreerd is en die homogeniteit verbeter kan word.